ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T38506—2020 动物细胞培养过程中生化参数的测定方法 Determination of biochemical parameters in animal cell culture process 2020-03-06实施 2020-03-06发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T38506—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、信达生物制药（苏州）有限公司、华派生物工程 集团有限公司、上海市计量测试技术研究院、上海张江生物技术有限公司、四川大学、成都柏奥特克生物 科技股份有限公司、上海迈泰君奥生物技术有限公司、泰州迈博太科药业有限公司、上海百迈博制药有 限公司。 本标准主要起草人：周李华、周凯松、宋航、邱文英、李剑凤、刘刚、黄林、马丽侠、李振华、杨坤、李妍、 蒋子敬、方鹏飞、崔利凯、郝伟伟、叶德萍、梁智杰、张大鹏、张丽燕、郭怀祖、徐进、郭清城、戴建新， 1 GB/T385062020 动物细胞培养过程中生化参数的测定方法 1范围 本标准规定了动物细胞规模培养过程中细胞密度、细胞活率、PH值、溶解氧、渗透压、葡萄糖含量、 细菌内毒素、乳酸含量的测定方法。 本标准适用于中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、小鼠骨髓瘤细胞（NSO、SP2/O）、非洲绿猴肾细胞 （Vero）、乳仓鼠肾细胞（BHK-21）、犬肾表皮细胞（MDCK）、猪睾丸细胞（ST）规模培养过程中生化参数 的检测，其他真核细胞规模培养过程中生化参数的检测也可参考使用。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 WS/T350血清葡萄糖测定参考方法 中华人民共和国药典（2015年版）二部（国家药典委员会） 中华人民共和国药典（2015年版）三部（国家药典委员会） 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 celldensity 细胞密度 细胞通过培养后，单位体积样品中细胞的总数。 3.1.2 细胞活率cell viability 细胞培养过程中，活细胞数目占总细胞数目的百分比。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ATP：腺苷三磷酸（Adenosinetriphosphate) NADH：还原型辅酶I（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原态）（Nicotinamideadeninedinucleotide） NAD(P）：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate) NAD(P）H：还原型辅酶IⅡI（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原态）（Nicotinamideadenine dinucleotide phosphate) OPC：开放平台通信（OpenPlatformCommunications） PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline） 1 GB/T385062020 4一般要求 4.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯或药用级的试剂及符合《中华人民共和国药典》 （2015年版）二部中规定的纯化水或注射用水。 4.2试验使用的试剂质量应避免过期造成的试剂性能改变。因此测定前应根据试剂说明书或产品质 检报告验证试剂质量。 注：荧光染料、缓冲液等试剂不宜长时间保存。台盼蓝会由于错配导致死细胞测量结果过高或过低 4.3为减少或避免取样可能导致的污染风险，细胞培养过程中各参数测定宜采用在线检测。 4.4在线检测时，相关设备应根据生产厂商的安装确认方案、操作确认方案进行确认，并将其形成文 件。在测定前，生产厂商和/或使用者应进行设备性能确认。 4.5在线检测时电极直接插人细胞发酵液中检测，无需取样。离线检测时，应按照无菌操作要求进行 取样，取样后按照检测参数和检测方法要求，进行离心、稀释等样品处理后立即检测，不能立即检测的样 品应放置于2℃～8℃并在不超过6h内检测 5 细胞密度的测定 5.1 悬浮细胞密度的测定 SZC 5.1.1血球计数法 5.1.1.1原理 将待测样品悬浮液置于血球计数板上，于显微镜下直接计数，进而推算出细胞数目。 5.1.1.2 试剂和材料 PBS缓冲液：可自行配制亦可购买商业化产品。 5.1.1.3 仪器设备及器具 5.1.1.3.1 血球计数板：16格×25格或25格×16格 5.1.1.3.2 倒置显微镜：放大倍数×400。 5.1.1.3.3微量移液器：20μL~200μL、100μL~1000μL。 5.1.1.4测定步骤 取900μLPBS缓冲液至离心管中，加入细胞悬液100μL，依次进行10倍系列稀释，取适宜稀释度 进行计数，使得细胞数量每大方格为100个～300个。将盖玻片盖于计数板中心上方，上下吹打，轻轻 混勾，用微量移液器将细胞悬液沿盖玻片边缘缓缓加人，不留气泡，不外溢，静置2min～3min。在显 微镜下对大方格的细胞进行计数，重复计数三次，取平均数。 注：实际检测过程中，可根据预计细胞密度调整所需PBS缓冲液和细胞悬液用量 5.1.1.5 结果计算 16格×25格的血球计数板按式（1）计算，25格×16格的血球计数板按式（2）计算。 :(1) 100 2 GB/T38506—2020 .(2) 80 式中： N一一每毫升悬浮液中细胞数，单位为个； A——计数板观察细胞数，单位为个； d —细胞溶液的总稀释倍数。 计算结果表示为整数。 5.1.2自动图像分析法 5.1.2.1原理 将采集的源图像数据进行平滑处理，通过直方图阈值处理，再经过腐蚀去填充孔洞，图像灰度化、对 比度增强、边缘检测、二值化变换以及数学形态学和修正一系列图像处理计数和分析，得出细胞的确切 数量。 5.1.2.2试剂 台盼蓝溶液（0.4%，W/V）：称取4.00g台盼蓝，加少量水研磨，用水溶解后定容至100mL，用定性 滤纸过滤，4℃存放。使用时，用PBS溶液稀释至0.4%。根据需要可直接购买商业化商品。 5.1.2.3仪器设备 自动细胞计数仪：主要由图像处理系统、图像预处理系统、图像分割和图像计数四部分组成 5.1.2.4分析步骤 启动自动细胞计数仪，设定细胞类型。根据仪器的线性范围和上样体积要求取适量细胞悬液加至 台盼蓝染料中（细胞悬液和台盼蓝染料按照1：1比例混匀），上下吹打，轻轻混匀。取适量样本混合物 加至计数池中，按照仪器操作说明，通过高清图像分析系统，自动分析细胞密度、活率及形态。 注：可使用其他等效染料，如噻唑蓝等 5.1.3电容法 5.1.3.1原理 根据测定时的细胞悬液浓度建立细胞悬液浓度与电容值线性关系，计算出K值。将常数K值输 入在线细胞检测仪检测系统中，得到细胞密度。 5.1.3.2设备 电容法在线细胞检测仪：测量范围，0pF~400pF；精度，0.01pF。 5.1.3.3测定步骤 5.1.3.3.1在线细胞检测仪的电容“0"点校准 接通电源，开机稳定30min，将电极放入空白细胞培养液中，并设置合适的温度、搅拌转速以及 pH，各参数需与细胞培养过程中的参数保持一致，待电容数据稳定后进行电容“O”点校准。 注：具体校准操作依据厂家要求进行相应调整。 5.1.3.3.2细胞密度与在电容值正相关常数"K”确定 3